ta克隆原理及流程(ta克隆原理)

导读 您好,今天张张来为大家解答以上的问题。ta克隆原理及流程,ta克隆原理相信很多小伙伴还不知道,现在让我们一起来看看吧!1、ta克隆方法(ori...

您好,今天张张来为大家解答以上的问题。ta克隆原理及流程,ta克隆原理相信很多小伙伴还不知道,现在让我们一起来看看吧!

1、ta克隆方法(originaltacloningkit)把pcr片断与一个具有3-t突出的载体dna连接起来的方法。

2、因为pcr反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在3加上a。

3、例如:taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,pcr反应时在每条pcr扩增产物的3端自动添加一个3-a突出端。

4、只有用经过特殊处理的具有3-t突出末端的dna片断才能通过t/a配对进行连接。

5、 通过pcr的方法扩增目的基因片断的过程中,由于往往不清楚目的基因的dna序列,获得的目的片断通常需要通过ta克隆的方法,重组到t-载体中,通过序列测定清楚dna序列。

6、由于在pcr过程中,使用的dna聚合酶不同,往往分为2种情况:(1)使用不同的taq酶,在pcr扩增循环结束后,加上72℃10分钟一个过程,taq酶可以在扩增产物的3末端加上a,因此pcr产物回收纯化后可以和t载体直接连接。

7、(2)使用高保真的dna聚合酶,如pfu酶,由于其不能在扩增产物的3末端加上a,得到的dna序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加a的过程,通常是以pcr回收产物为模板,加上一定量的普通taq酶和反应液,加入datp(或dntp),72℃10分钟,然后将加a产物直接用于ta连接。

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